构建载体遇到了问题，有特异性片段，测序无信号或者连接的是T载

Question

请问一下大家，有没有人碰到这种情况：
构建表达载体时，用的同源重组法，扩出了目的条带，单酶切了载体，也长了单菌落，PCR验证了。但是送测序得到的结果是目的+T载。我不知道是哪里出了问题。是没扩出同源臂吗？还是载体酶切没切开？我重做了两次扩增和酶切结果都一样。所以迷茫了

后来听别人说建议我菌液PCR用载体引物F+目的片段引物R验证，出现条带单一明亮且正确，但是用载体的引物测单向却失败无信号。 测通结果依旧是目的片段+T载体 ，请问大家是哪里出了问题呀？

Answer 1

该回答引用GPTᴼᴾᴱᴺᴬᴵ
这种情况可能出现在同源重组法构建表达载体时，载体与目的片段连接的特异性不高或存在其他问题，导致测序结果中出现T载体或者目的片段+T载体的情况。

其中可能的问题有：

1. 同源重组法效率低，没有扩增出同源臂或同源臂长度不够，导致连接的特异性较低；
2. 载体酶切没有切开或者酶切效率不高，导致连接的特异性较低；
3. 测序结果存在污染或误判，导致结果不准确。

针对这种情况，可以尝试以下措施：

1. 重新设计同源重组法扩增引物，确保同源臂长度足够，提高连接的特异性；
2. 重新酶切载体，确保酶切完全，提高连接的特异性；
3. 对扩增产物进行纯化和测序验证，确认扩增产物的正确性；
4. 选择其他测序方法或测序公司，比如Sanger测序等，以便更好地验证扩增产物的正确性。

总之，针对这种情况，需要从多个方面排查问题，确认扩增产物的正确性，以便得到准确的结果。

Answer 2

好的！谢谢大佬！！