关于研究生做qpcr实验遇见的问题

Question

想问一下大家，为什么跟师姐扩增一样的组织样本，扩增一样的基因，师姐做出来actin的ct为16，我做的在18.19。虽然师姐跟我做的actin和目的基因的ct差值都在5左右，为什么我的都要高一点呢? 我实在找不到问题在哪里

Answer 1

🕒上午好，题主！目前：🟢[在线]
📢参考GPT-4o mini 模型、由清水白石008整理提供！
📣今日金句：“成功是不断学习和成长的过程。”** — 亨利·福特

在qPCR实验中，即使使用相同的样本和相同的引物，CT值的差异可能由多种因素引起。以下是一些可能导致您和师姐的CT值不同的原因，以及一些建议来帮助您排查问题：

1. 样本质量

• RNA质量：确保提取的RNA质量良好，未降解。RNA的完整性可以通过琼脂糖凝胶电泳或生物分析仪进行评估。
• 样本处理：样本的处理和储存条件可能影响RNA的质量和稳定性。

2. 实验操作

• 反应体系：确保您和师姐的qPCR反应体系完全一致，包括引物浓度、酶、缓冲液和模板量等。
• 混合均匀性：在准备反应液时，确保充分混合，避免气泡和不均匀分布。
• PCR循环条件：确认PCR循环条件（如退火温度、延伸时间等）是否一致。

3. 引物特性

• 引物设计：确保引物的特性（如特异性、效率）相同。可以通过梯度PCR或标准曲线来评估引物的扩增效率。
• 引物浓度：引物的浓度过高或过低都可能影响扩增效率。

4. 仪器和试剂

• 仪器校准：确保qPCR仪器的校准和维护良好，避免仪器误差。
• 试剂批次：不同批次的试剂可能存在差异，确保使用相同批次的试剂。

5. 数据分析

• CT值计算：确保CT值的计算方法一致，使用相同的基线和阈值设置。
• 相对定量：在进行相对定量时，确保使用相同的参考基因（如actin）进行校正。

6. 技术重复

• 重复实验：进行技术重复（如每个样本至少做三次重复）以评估实验的可重复性和一致性。

7. 其他因素

• 实验环境：实验室环境（如温度、湿度）可能影响反应，确保在相似的条件下进行实验。
• 操作习惯：不同的操作习惯和技巧可能导致结果的差异，尽量保持一致的操作流程。

结论

建议您逐一排查上述因素，找出可能导致CT值差异的原因。与师姐沟通，了解她的实验细节和操作步骤，可能会帮助您发现问题所在。qPCR实验的成功往往依赖于细致的操作和严格的控制，祝您实验顺利！如果还有其他问题，欢迎随时询问。