10X单细胞建库时，如何避免细胞双率过高？

Question

在10X单细胞建库过程中，细胞双率（doublet rate）过高是一个常见问题。这不仅影响数据分析的准确性，还可能导致实验结果偏差。为降低细胞双率，首先需优化样本制备流程，确保组织消化充分且温和，以减少细胞聚集体的形成。其次，严格控制细胞悬液的质量，使用健康的细胞，并调整细胞浓度至推荐范围（通常为700-1200 cells/μL），避免浓度过高导致双细胞封装。此外，使用过滤器去除大颗粒杂质，也能有效减少双率。最后，在实验设计阶段合理设置目标细胞数与油滴数的比例，可进一步降低细胞双封装的概率。通过以上措施，能够显著提高单细胞数据质量，确保后续分析的可靠性。

Answer 1

1. 初步了解：什么是细胞双率（Doublet Rate）问题？

在单细胞测序实验中，细胞双率是指两个或多个细胞被封装到同一个GEM（Gel Bead in Emulsion）中的概率。这种现象会直接影响数据分析的准确性和实验结果的可靠性。

• 高双率可能导致错误的基因表达模式分析。
• 影响细胞类型分类和功能推断。
• 增加数据处理的复杂性。

为确保实验质量，降低细胞双率是关键步骤之一。

2. 技术分析：双率过高的常见原因

以下是导致细胞双率过高的几个主要技术问题：

问题	可能原因	解决方案
组织消化不充分	细胞聚集体未完全解离	优化酶消化条件，延长消化时间
细胞悬液浓度过高	过多细胞进入系统	调整细胞浓度至700-1200 cells/μL
样本中含有大颗粒杂质	过滤不彻底	使用40μm过滤器去除杂质
目标细胞数与油滴比例不合理	封装效率低	调整目标细胞数与油滴数比例

3. 解决方案：如何优化样本制备流程

为了降低双率，可以从以下几个方面优化样本制备流程：

1. 优化组织消化：选择适当的酶和消化时间，确保组织充分解离，同时避免过度消化损伤细胞。
2. 控制细胞悬液质量：使用健康、活性高的细胞，避免死细胞污染，并通过台盼蓝染色检测细胞活力。
3. 调整细胞浓度：将细胞浓度调整至推荐范围（700-1200 cells/μL），以减少双细胞封装的可能性。
4. 过滤样本：使用40μm过滤器去除细胞聚集体和其他大颗粒杂质。

此外，合理设计实验参数也是关键。

4. 实验设计：降低双率的策略

在实验设计阶段，可以通过以下措施进一步降低双率：

# 计算目标细胞数与油滴数的比例
target_cells = 10000
desired_doublet_rate = 0.05
beads_per_cell = 1 / (1 - desired_doublet_rate)
total_beads = target_cells * beads_per_cell

print(f"需要的总油滴数为: {int(total_beads)}")
    

通过上述计算，可以确定合适的油滴数，从而有效降低双率。

5. 流程图：从样本制备到数据分析的整体流程

graph TD;
            A[样本制备] --> B{优化组织消化};
            B --> C[控制细胞悬液质量];
            C --> D[调整细胞浓度];
            D --> E[过滤样本];
            E --> F[实验设计];
            F --> G[降低双率];
            G --> H[数据分析];

以上流程展示了从样本制备到数据分析的关键步骤，每一步都对最终的数据质量有重要影响。