cuttag差异peaks分析

Question

我是一个细胞系nc kd掉某一个基因 用H3k27ac做的cuttag 每组两个重复 macs2做完callpeaks之后(实验组相对于对照组做的） 在用diffbind做差异peaks的时候，提示我至少有两个分组。
我的sample sheet如下。

我不明白的是 callpeaks的时候 只有实验组的peaks，但是这个差异分析时候要求两组，文件是应该这样准备吗

Answer 1

引自免费微信小程序：皆我百晓生

针对您提供的样本表（SampleSheet）和在使用R语言中的DiffBind包进行cuttag数据（H3K27ac ChIP-seq）差异peaks分析时遇到的问题，我将为您提供详细的解决方案。根据您的描述，您已经成功进行了Macs2的callpeaks操作，并为每个实验组（KD-ac-1、KD-ac-2）生成了对应的peaks文件。然而，在使用DiffBind进行差异分析时，提示需要至少两个分组。这可能是由于样本表的组织方式不够清晰，导致DiffBind未能正确识别对照组（NC-ac-1、NC-ac-2）。以下是调整样本表并使用DiffBind进行差异分析的步骤：

1. 重新组织样本表

根据您的样本表内容，我们需要明确实验组（KD，knockdown）与对照组（NC）的关系。按照DiffBind的格式要求，可以创建一个新的样本表（如：DiffBind_SampleSheet.csv），其内容应如下所示：

SampleID,Treatment,Factor,Condition,BamReads,BamControl,Peaks,PeakCaller,Tissue
KD-ac-1,KD,H3K27ac,NA,E:/BaiduSyncdisk/KD-ac-1.sorted.bam,NC-ac-1,E:/BaiduSyncdisk/NC-ac-1.sorted.bam,E:/BaiduSyncdisk/KD-ac-1_peaks.narrowPeak,narrow
KD-ac-2,KD,H3K27ac,NA,E:/BaiduSyncdisk/KD-ac-2.sorted.bam,NC-ac-2,E:/BaiduSyncdisk/NC-ac-2.sorted.bam,E:/Baisk/KD-ac-2_peaks.narrowPeak,narrow
NC-ac-1,Control,H3K27ac,NA,,E:/BaiduSyncdisk/NC-ac-1.sorted.bam,,
NC-ac-2,Control,H3K27ac,NA,,E:/BaiduSyncdisk/NC-ac-2.sorted.bam,,

这里我们新增了Treatment列，分别标记实验组（KD）和对照组（Control）。同时，将对照组的BamReads留空，因为它们仅作为对照，不参与callpeaks。此外，将对照组的Peaks列留空，因为DiffBind会自动为对照组使用相应的实验组peaks进行比对。

2. 使用DiffBind进行差异分析

接下来，您可以使用以下R代码片段进行差异peaks分析：

# 加载所需库
library(DiffBind)

# 读取重新组织的样本表
sampleSheet <- read.csv("DiffBind_SampleSheet.csv", stringsAsFactors = FALSE)

# 创建DiffBind对象
dbObj <- dba(sampleSheet = sampleSheet, peaks = NULL, bUseSummarizeOverlaps = TRUE)

# 进行标准化处理
dbObj <- dba.count(dbObj, summits = 250)

# 设置分组参数
groups <- dbObj$metadata$Treatment

# 进行差异分析
dbObj <- dba.analyze(dbObj, method=DBA_DESEQ2, minOverlap=3, bUsePval=TRUE, bFullLibrarySize=FALSE, design=~Treatment)

# 查看差异peaks结果
summary(dbObj)

# 可选：保存差异peaks结果
dba.writeDBA(dbObj, file="H3K27ac_diffPeaks.db")

这段代码首先加载了DiffBind库，然后读取了重新组织后的样本表。接着，创建dba对象，设置标准化参数，并进行peak计数。在进行差异分析时，我们指定了分组依据为Treatment列，并使用DESeq2方法进行统计分析。最后，输出差异peaks的摘要信息，并可选择将结果保存为.db文件。

通过上述步骤，您应该能成功使用DiffBind进行cuttag差异peaks分析。如有其他疑问或需要进一步的帮助，请随时告知。