我是一个细胞系nc kd掉某一个基因 用H3k27ac做的cuttag 每组两个重复 macs2做完callpeaks之后(实验组相对于对照组做的) 在用diffbind做差异peaks的时候,提示我至少有两个分组。
我的sample sheet如下。
我不明白的是 callpeaks的时候 只有实验组的peaks,但是这个差异分析时候要求两组,文件是应该这样准备吗
我是一个细胞系nc kd掉某一个基因 用H3k27ac做的cuttag 每组两个重复 macs2做完callpeaks之后(实验组相对于对照组做的) 在用diffbind做差异peaks的时候,提示我至少有两个分组。
我的sample sheet如下。
引自免费微信小程序:皆我百晓生
针对您提供的样本表(SampleSheet)和在使用R语言中的DiffBind
包进行cuttag数据(H3K27ac ChIP-seq)差异peaks分析时遇到的问题,我将为您提供详细的解决方案。根据您的描述,您已经成功进行了Macs2的callpeaks操作,并为每个实验组(KD-ac-1、KD-ac-2)生成了对应的peaks文件。然而,在使用DiffBind
进行差异分析时,提示需要至少两个分组。这可能是由于样本表的组织方式不够清晰,导致DiffBind
未能正确识别对照组(NC-ac-1、NC-ac-2)。以下是调整样本表并使用DiffBind
进行差异分析的步骤:
1. 重新组织样本表
根据您的样本表内容,我们需要明确实验组(KD,knockdown)与对照组(NC)的关系。按照DiffBind
的格式要求,可以创建一个新的样本表(如:DiffBind_SampleSheet.csv
),其内容应如下所示:
SampleID,Treatment,Factor,Condition,BamReads,BamControl,Peaks,PeakCaller,Tissue
KD-ac-1,KD,H3K27ac,NA,E:/BaiduSyncdisk/KD-ac-1.sorted.bam,NC-ac-1,E:/BaiduSyncdisk/NC-ac-1.sorted.bam,E:/BaiduSyncdisk/KD-ac-1_peaks.narrowPeak,narrow
KD-ac-2,KD,H3K27ac,NA,E:/BaiduSyncdisk/KD-ac-2.sorted.bam,NC-ac-2,E:/BaiduSyncdisk/NC-ac-2.sorted.bam,E:/Baisk/KD-ac-2_peaks.narrowPeak,narrow
NC-ac-1,Control,H3K27ac,NA,,E:/BaiduSyncdisk/NC-ac-1.sorted.bam,,
NC-ac-2,Control,H3K27ac,NA,,E:/BaiduSyncdisk/NC-ac-2.sorted.bam,,
这里我们新增了Treatment
列,分别标记实验组(KD)和对照组(Control)。同时,将对照组的BamReads
留空,因为它们仅作为对照,不参与callpeaks。此外,将对照组的Peaks
列留空,因为DiffBind
会自动为对照组使用相应的实验组peaks进行比对。
2. 使用DiffBind进行差异分析
接下来,您可以使用以下R代码片段进行差异peaks分析:
# 加载所需库
library(DiffBind)
# 读取重新组织的样本表
sampleSheet <- read.csv("DiffBind_SampleSheet.csv", stringsAsFactors = FALSE)
# 创建DiffBind对象
dbObj <- dba(sampleSheet = sampleSheet, peaks = NULL, bUseSummarizeOverlaps = TRUE)
# 进行标准化处理
dbObj <- dba.count(dbObj, summits = 250)
# 设置分组参数
groups <- dbObj$metadata$Treatment
# 进行差异分析
dbObj <- dba.analyze(dbObj, method=DBA_DESEQ2, minOverlap=3, bUsePval=TRUE, bFullLibrarySize=FALSE, design=~Treatment)
# 查看差异peaks结果
summary(dbObj)
# 可选:保存差异peaks结果
dba.writeDBA(dbObj, file="H3K27ac_diffPeaks.db")
这段代码首先加载了DiffBind
库,然后读取了重新组织后的样本表。接着,创建dba
对象,设置标准化参数,并进行peak计数。在进行差异分析时,我们指定了分组依据为Treatment
列,并使用DESeq2方法进行统计分析。最后,输出差异peaks的摘要信息,并可选择将结果保存为.db
文件。
通过上述步骤,您应该能成功使用DiffBind
进行cuttag差异peaks分析。如有其他疑问或需要进一步的帮助,请随时告知。