velocyto 运行出现Not found cell and umi barcode in entry Xof the bam file

Question

velocyto 运行出现“WARNING - Not found cell and umi barcode in entry 1003 of the bam file”

以下是我运行记录：

2024-08-08 13:12:20,559 - ERROR - This is an older version of cellranger, cannot check if the output are ready, make sure of this yourself
2024-08-08 13:12:20,560 - DEBUG - Using logic: Default
2024-08-08 13:12:20,580 - INFO - Read 6465 cell barcodes from /home/data/t100554/GSE130973/re6/outs/filtered_feature_bc_matrix/barcodes.tsv.gz
2024-08-08 13:12:20,580 - DEBUG - Example of barcode: AAACCTGAGGCCGAAT and cell_id: re6:AAACCTGAGGCCGAAT-1
2024-08-08 13:12:20,582 - DEBUG - Peeking into /home/data/t100554/GSE130973/re6/outs/possorted_genome_bam.bam
2024-08-08 13:12:20,697 - WARNING - Not found cell and umi barcode in entry 0 of the bam file
2024-08-08 13:12:20,698 - WARNING - Not found cell and umi barcode in entry 111 of the bam file
2024-08-08 13:12:20,698 - WARNING - Not found cell and umi barcode in entry 256 of the bam file
2024-08-08 13:12:20,699 - WARNING - Not found cell and umi barcode in entry 872 of the bam file
2024-08-08 13:12:20,700 - WARNING - Not found cell and umi barcode in entry 974 of the bam file
2024-08-08 13:12:20,700 - WARNING - Not found cell and umi barcode in entry 978 of the bam file
2024-08-08 13:12:20,703 - WARNING - The file /home/data/t100554/GSE130973/re6/outs/cellsorted_possorted_genome_bam.bam already exists. The sorting step will be skippe
2024-08-08 13:12:20,703 - INFO - Load the annotation from /home/data/t100554/refdata-gex-GRCh38-2024-A/genes/genes.gtf
2024-08-08 13:12:26,722 - DEBUG - Parsing Chromosome GL000009.2 strand - [line 0]
2024-08-08 13:12:26,722 - DEBUG - Done with GL000009.2- [line 7]
2024-08-08 13:12:26,722 - DEBUG - Assigning indexes to genes
2024-08-08 13:12:26,722 - DEBUG - Seen 1 genes until now
2024-08-08 13:12:26,722 - DEBUG - Parsing Chromosome GL000194.1 strand - [line 8]
2024-08-08 13:12:26,722 - DEBUG - Done with GL000194.1- [line 33]
2024-08-08 13:12:26,722 - DEBUG - Assigning indexes to genes
2024-08-08 13:12:26,722 - DEBUG - Seen 3 genes until now
2024-08-08 13:12:26,722 - DEBUG - Parsing Chromosome GL000195.1 strand - [line 34]
2024-08-08 13:12:26,722 - DEBUG - Done with GL000195.1- [line 43]
......

后续继续运行中，并未出现错误而停止

关于 warning这几行我尝试根据这篇贴文进行解决https://cloud.tencent.com/developer/article/1877797
但还出现这个问题。请问我需要在意这几行waring嘛？
还有关于第一行的“ERROR - This is an older version of cellranger, cannot check if the output are ready, make sure of this yourself”，我安装的是最新版，为什么还会这样子呢？但没有影响后续的运行，这个要如何解决呢？

感谢大家解答我的疑惑！！

Answer 1

以下回复参考：皆我百晓生、券券喵儿等免费微信小程序作答:

在处理bam文件时遇到"not found cell and umi barcode in entry x"的警告可能是由于一些原因导致bam文件中的cell和umi信息丢失了。这通常是因为细胞分选过程中的某些问题或者bam文件本身的问题。

首先，确保您正在使用的版本是当前可用的最新版本，因为旧版本可能不支持检查输出是否准备就绪。您可以通过--version选项查看当前版本号：

velocyto --version

然后，检查是否有任何已存在的bam文件与您的bam文件相同。如果您已经存在一个名为cellsorted_possorted_genome_bam.bam的文件，您可以跳过此步骤并稍后运行velocyto。如果它已经被删除，那么您可能需要重新创建一个新的bam文件以包含所有细胞和umi信息。

对于第一条警告，表示您正在使用较旧的Cell Ranger版本。这可能导致一些功能性限制。建议您更新到最新的Cell Ranger版本，以便更好地处理这些问题。如果您已经在使用最新版本，但仍然遇到类似问题，那么可能是某个特定的bam文件存在问题，或者您的环境设置有问题。在这种情况下，您可以尝试将bam文件从旧设备复制到新设备上，看看是否能解决问题。

为了更清楚地了解问题的原因，您可以考虑打印出velocyto运行时的一些关键日志信息，例如：

velocyto --help

这会显示velocyto的基本命令以及一些重要的参数，可以帮助您理解当前正在运行的版本和配置。此外，还可以尝试使用--debug选项来获取更多的调试信息，例如：

velocyto --debug --version

希望这些信息对您有所帮助！