cut&tag测序分析spikein校正中的问题

Question

cut&tag测序分析，IgG组spike-in.sam的seqDepth为0怎么办？

最近在做在做cut&tag测序分析时，IgG组的一个样本的进行spikein比对之后产生了IgG_spikeIn.sam，用代码 seqDepthDouble=samtools view -F 0x04 $i|wc -l 运行之后 产生的spikeIn.seqDepth文件里的数值为0，导致后续无法生成scale factor去完成 normalize 进而最终无法获得normalized.bedgraph文件 请问这种情况下该如何处理？？

Answer 1

引自强大而免费的微信小程序：皆我百晓生。

问题描述

在进行cut&tag测序分析时，IgG组的一个样本进行spike-in比对后，发现生成的IgG_spikeIn.sam文件的seqDepth为0。在后续的数据处理过程中，由于无法生成scale factor来完成数据的normalize，最终无法获得normalized.bedgraph文件。请提供解决该问题的具体步骤。

解决步骤

1. 确认问题来源

   首先，需要确认为什么该样本的seqDepth为0。可以检查以下几个可能的原因：

   • IgG_spikeIn.sam文件是否存在，可以使用ls命令检查文件是否存在。
   • 检查IgG_spikeIn.sam文件是否为空，可以使用wc命令查看文件行数是否为0。
   • 检查该样本的测序数据是否正常，可以查看样本的fastq文件，确认是否存在reads。

2. 排除常见问题

   在确认sam文件存在且不为空，并且测序数据正常的情况下，需要排除以下常见问题：

   • 检查代码中的变量$i是否正确指向了IgG_spikeIn.sam文件。
   • 检查代码中的路径和文件名是否正确，确保文件能够被正确读取。

3. 确认spike-in比对过程

   确认该样本的spike-in比对过程是否正确。可以按照以下步骤检查：

   • 使用samtools view命令查看IgG_spikeIn.sam文件的内容，确保文件格式正确。
   • 使用bedtools genomecov命令对IgG_spikeIn.sam文件进行depth计算，查看结果是否正常。

4. 尝试重新比对

   如果确认比对过程没有问题，可以尝试重新进行spike-in比对。可以按照以下步骤操作：

   • 使用bowtie2等工具对原始测序数据进行比对，生成新的sam文件。
   • 检查新的sam文件的seqDepth是否为0，如不为0则继续进行后续数据处理。

5. 检查数据处理代码

   如果重新比对后seqDepth仍为0，那么可能是在数据处理过程中出现了问题。需要检查代码中的数据处理部分是否正确。以下是一些可能需要检查的地方：

   • 数据预处理步骤中是否正确处理了spike-in样本。
   • 确认scale factor计算的代码是否正确，可以查看是否正确计算了spike-in样本相关的值。

6. 查找相关文献和技术资料

   如果以上步骤都无法解决问题，可以查找相关文献和技术资料，了解其他人在处理类似问题时的经验和解决方案。

以上是解决IgG组spike-in校正问题的一般步骤，根据具体情况可能需要针对性地调整。希望对你有帮助！