RNA-seq仅提供normalized reads (DESeq2)，如何进行后续分析

Question

想从GEO数据库下载高通量测序数据RNA-Seq，简单做一篇生信分析。作者上传的数据不是原始的counts数据，只提供了一个normalized reads值 normalized reads (DESeq2)，请问后续如何进行差异分析？是用limma直接分析？还是用DESeq2先转化成counts再进行分析？，如果想用这个数据做生信分析寻找目的基因，被认可吗？

Answer 1

参考gpt
在使用从GEO数据库下载的normalized reads (DESeq2)数据进行后续分析时，需要注意以下几点：

1. 差异表达分析

使用normalized reads (DESeq2)数据直接进行差异表达分析并不是标准做法，因为这些数据已经经过了归一化处理，并不是真正的原始counts数据。常用的方法是对原始counts数据进行归一化和差异表达分析，但是在没有原始counts数据的情况下，可以尝试以下几种方法：

a. 使用Limma分析

使用limma包分析normalized reads数据是一种常见的方法。limma包的voom函数可以将RNA-seq数据转换为适合线性建模的形式。虽然voom函数通常用于处理原始counts数据，但也可以用于处理已经归一化的数据。

library(limma)

# 假设normalized_data是你的归一化数据矩阵，rownames是基因，colnames是样本
design <- model.matrix(~ 0 + factor(c(1, 1, 2, 2)))  # 示例设计矩阵
colnames(design) <- c("Group1", "Group2")

# 使用voom转换
v <- voom(normalized_data, design)

# 差异表达分析
fit <- lmFit(v, design)
contrast.matrix <- makeContrasts(Group2-Group1, levels=design)
fit2 <- contrasts.fit(fit, contrast.matrix)
fit2 <- eBayes(fit2)
results <- topTable(fit2, adjust="fdr")

b. 使用DESeq2的变体

如果一定要使用DESeq2进行分析，可以尝试将normalized reads数据反归一化为类似counts的数据，但这种方法不太常见且容易引入误差。不推荐使用。

2. 数据的认可度

使用已经归一化的normalized reads数据进行分析在某些情况下是可以接受的，但在严格的科研环境中，分析原始counts数据通常更为理想。如果你计划发表论文或进行严格的生信分析，建议尽量获取原始counts数据。

3. 寻找目的基因

尽管使用normalized reads数据进行分析有其局限性，但你仍然可以用这些数据进行初步的探索性分析，寻找差异表达的目的基因。要确保分析结果的可靠性，可以考虑多种分析方法并交叉验证结果。

4. 补充分析

除了差异表达分析，你还可以进行其他类型的分析，例如基因集富集分析（GSEA），共表达网络分析（WGCNA）等，使用normalized reads数据是完全可以的。

5. 数据可视化

无论使用哪种方法进行分析，都可以用各种可视化手段来展示结果，例如火山图（volcano plot）、热图（heatmap）等。

library(ggplot2)

# 示例火山图
ggplot(results, aes(x=logFC, y=-log10(P.Value))) +
  geom_point() +
  theme_minimal()

总结

虽然直接使用normalized reads数据进行差异表达分析并不理想，但在没有原始counts数据的情况下，limma包的voom方法是一种可行的选择。在发表论文或进行更严格的分析时，尽量获取原始counts数据以确保结果的可靠性和认可度。